普通PCR和实时荧光定量PCR有什么区别？

聚合酶链反应（PCR）是一种革命性的技术，它通过将小型DNA样品扩增成较大的可检测量，从而改变了分子生物学。常规的PCR方法（通常称为正常PCR）广泛用于研究，诊断和生物技术中的各种应用。但是，实时PCR（也称为定量PCR或QPCR）的开发已将标准PCR技术提升到了新的水平，为DNA和RNA的定性和定量分析提供了高级功能。

在本文中，我们将探讨普通PCR和实时PCR之间的根本差异，重点关注其关键功能，优势和应用。通过了解这些差异，您可以确定哪种方法最适合您在研究或诊断方面的特定需求。

什么是普通PCR？

正常PCR，也称为常规PCR，是用于扩增特定DNA序列的传统方法。该过程涉及通过一系列温度循环扩增DNA模板，从而使DNA，底漆结合（退火）和通过DNA聚合酶延伸的变性。最终结果是扩增的DNA产物（扩增子），可以分析目标序列的存在。

普通PCR的关键特征：

1。简单且具有成本效益：传统PCR不需要专门的试剂，例如荧光探针或染料，使其成为基本DNA扩增的更实惠的选择。

2。后PCR分析：放大后，通常通过诸如凝胶电泳等技术来分析DNA产物，以确认靶DNA的存在和大小。该分析发生在PCR过程结束时。

3。定性结果：正常PCR主要提供定性结果，这意味着它检测到目标DNA的存在或不存在，但不提供定量信息。

正常PCR的局限性：

●耗时：PESTCR分析（例如凝胶电泳）为工作流程增加了时间，结果无法立即可用。

●有限的灵敏度和精度：端点分析不允许精确测量扩增的DNA量。 PCR条件和样品处理中的变异性会导致不一致的结果。

●低动态范围：正常PCR的动态范围有限，这意味着它可能无法准确测量DNA量的小差异。

什么是实时PCR？

实时PCR，也称为定量PCR（QPCR），是PCR的高级版本，可实时监视和定量DNA扩增。与正常PCR（仅在反应结束时检测到DNA产物）不同，实时PCR连续测量反应本身中放大DNA的量，从而提供实时数据。这使研究人员可以跟踪PCR扩增的进度，并确定样品中靶DNA的确切量。

实时PCR的主要特征：

1。连续监测： 实时PCR系统 在每个扩增周期内测量荧光信号的积累。这是通过使用与DNA产物结合的荧光染料或探针来实现的。发出的荧光与扩增的DNA量成正比，从而实现了实时检测和定量。

2。定量结果：实时PCR提供定量数据，使研究人员能够确定样品中DNA分子的确切数量。这是通过测量荧光强度并使用它来计算每个扩增周期中DNA量来实现的。

3。敏感和精确：实时PCR高度敏感，甚至可以在样品中检测到少量DNA。这使其非常适合需要精确量化DNA或RNA水平的应用。

4。没有PCR后处理：与正常的PCR不同，实时PCR不需要PCR后分析，例如凝胶电泳。在反应过程中收集和分析数据，从而使过程更快并降低了污染的潜力。

实时PCR的应用：

●基因表达分析： 实时PCR 广泛用于通过量化mRNA水平来测量基因表达。这对于研究如何在不同条件下（例如疾病期间或对药物治疗的反应）调节基因至关重要。

●病原体检测：实时PCR通常用于通过测量样品中其遗传物质的量来检测和量化包括病毒和细菌在内的病原体。

●拷贝数变化（CNV）：实时PCR允许检测DNA拷贝数变化，这在遗传研究，癌症研究和诊断方面很重要。

●病毒载荷的定量：实时PCR用于测量临床样品中的病毒载荷，这对于监测HIV，HIV，肝炎和Covid-19至关重要。

正常PCR和实时PCR之间的关键差异

1。检测方法

●正常PCR：在PCR循环结束时分析DNA扩增产物，通常使用凝胶电泳，该凝胶电泳根据大小将放大的DNA分离。此方法是耗时的，不提供实时数据。

●实时PCR：在整个PCR过程中，使用荧光染料或放大过程中发出光的探针监测扩增。这允许对DNA扩增进行实时监视，从而提供定量数据。

2。定量

●正常的PCR：PCR可以通过比较凝胶上的频带的强度来提供半定量结果，但这不是高度准确的。 DNA模板的数量不能精确确定。

●实时PCR： 实时PCR 提供了对DNA或RNA的准确量化，使研究人员能够在放大过程中的任何给定点测量目标DNA的量。这是通过计算循环阈值（CT）值来完成的，这反映了荧光超过定义阈值所需的周期数。

3。速度和效率

●正常PCR：正常PCR较慢，因为它需要PCR后分析（例如凝胶电泳）来检测和分析PCR产物。结果仅在反应完成后才可用。

●实时PCR：实时PCR更快，因为随着扩增的进展，它可以立即提供数据，并且不需要其他步骤，例如凝胶电泳。

4。灵敏度和精度

●正常PCR：传统PCR具有较低的灵敏度和精度，尤其是在测量少量DNA时。反应条件下的变异性也会影响结果的准确性。

●实时PCR：实时PCR高度敏感和精确，可以检测到偶数的DNA或RNA。这使其适用于需要高精度的应用，例如量化基因表达或检测低水平感染。

5。动态范围

●正常PCR：正常PCR的动态范围有限，这意味着它可能无法准确测量DNA量的较大变化。

●实时PCR：实时PCR提供更广泛的动态范围，使其可以测量从非常低到高水平的广泛的DNA浓度。

结论

总之，尽管正常PCR和实时PCR都具有扩增DNA的基本目的，但实时PCR比正常PCR具有显着的优势，尤其是在量化，灵敏度和速度方面。实时PCR实时监测放大过程并提供定量结果的能力使其成为现代分子生物学，诊断和研究应用的必不可少的工具。无论您是研究基因表达，检测病原体还是量化DNA，实时PCR都提供了传统PCR方法无法匹配的精度和效率水平。

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