数字PCR简介
数字PCR（DPCR）是在常规PCR和实时定量PCR（QPCR）之后开发的第三代PCR技术。它的核心原理是将含有靶核酸分子的反应混合物划分为成千上万个独立的微反应单元（例如微滴滴或微嵌段），每个单元内都会发生单个PCR扩增。
放大后，在每个单元上执行端点检测（通常是荧光信号的）。信号的存在或不存在确定该单元是否含有靶核酸分子。通过计算正单元的数量和应用泊松分布统计，可以直接计算原始样品中靶核酸的绝对拷贝数。
数字PCR的核心优势在于其绝对量化的能力而无需依赖标准曲线，从而导致更精确和可靠的结果。此外，它对抑制剂具有较高的耐受性，并在检测出极低丰度的靶标（例如罕见的突变，痕量病原体和循环肿瘤DNA（CTDNA））方面表现出极好的灵敏度。
这些特征使DPCR能够显示出生命科学研究和临床诊断的巨大应用价值和潜力，包括肿瘤液体活检，非侵入性产前诊断，精确的病原体检测，基因表达分析，转基因成分的定量以及参考标准的评估。
数字PCR的类型
数字PCR可以根据用于将样本分为许多单个反应单元的分区方法将数字PCR广泛分为三种主要类型：
基于液滴的数字PCR
这种方法将PCR混合物分成数万个微小的油包水珠，每个油包水滴都充当一个独立的PCR微反应器。使用微流体产生液滴，然后进行PCR扩增。扩增后，单独分析液滴的荧光，以确定阳性或阴性分配。这种方法提供了非常多的分区，因其灵敏度和精度而被广泛使用。
基于芯片的数字PCR
混合方法
每种分区策略将核酸分子分离成单独的反应室，从而使泊松统计量通过计数阳性和负分区来准确量化靶DNA或RNA分子。分区方法的选择会影响分区数量、分区体积、工作流复杂性和仪器要求。
数字PCR中的泊松统计数据
如何在数字PCR中计算拷贝数/液滴和拷贝数/µL？
过将每个液滴的目标分子拷贝数乘以有效液滴的数量来计算样品所有有效液滴中目标分子的拷贝总数。根据每液滴目标分子的已知拷贝数（λ）和液滴体积，还可以计算每微升的拷贝数。
数字PCR DRDX系列的工作流程是什么？
数字PCR（dPCR）检测工作流程始于从样品中提取核酸以分离DNA或RNA。提取后，纯化的核酸与PCR主混合物混合，包括引物、荧光探针、核苷酸、酶和专为液滴形成而设计的特殊超混合物。
数字PCR RS32系列的工作流程是什么？
数字PCR的优点和局限性
优点：
| 优势 | 描述 |
| 绝对定量 | 直接计算目标分子而无需标准曲线或参考，从而提高可靠性。 |
| 高精度和可重复性 | 提供更精确和可再现的结果，尤其是对于低丰度目标和小倍数的变化。 |
| 优越的灵敏度 | 检测极浓度的靶标，例如稀有突变，痕量病原体和ctDNA。 |
| 对抑制剂的高耐受性 | 分区可以减少PCR抑制剂的影响，即使在具有挑战性的样本中也可以进行稳健的量化。 |
| 不依赖放大效率 | 结果受PCR效率变化的影响较小，从而导致更准确的定量。 |
缺点：
| 劣势 | 描述 |
| 较窄的动态范围 | 有限数量的分区限制了可以准确量化的目标浓度的范围，通常需要对高度丰富的目标进行样品稀释。 |
| 成本更高 | DPCR的设备和消耗品通常比QPCR的设备昂贵。 |
| 较低的吞吐量 | DPCR通常每次运行更少的样本。 |
| 有限的试剂套件品种 | 商业化试剂套件的品种仍然有限，甚至更少的套件获得了用于医院的资格。 |
| 非可互换试剂套件 | 由于分区方法有所不同，因此来自不同数字PCR制造商的试剂套件不可互换。 |
数字PCR和QPCR的比较
比较表：QPCR与DPCR
| 功能/方面 | 实时荧光定量PCR（qpcr） | 数字PCR（DPCR） |
| 定量 | 相对或绝对（需要标准曲线或参考） | 绝对（无需标准或参考） |
| 反应格式 | 散装PCR，柔性反应体积 | 样品分区，固定分区卷 |
| PCR效率影响 | 受PCR效率变化的影响（指数阶段收集的数据） | 不受扩增效率的影响 |
| 对抑制剂的耐受性 | 容易发生抑制剂 | 较高的抑制剂耐受性 |
| 检测方法 | 实时检测 | 终点检测 |
| 动态范围 | 广泛的动态范围 | 较窄的动态范围 |
| 灵敏度 | 较高的变化，对稀有靶标敏感不太敏感 | 检测小小的变化和罕见目标，更高的灵敏度 |
| 可重复性 | 温和，可能受到各种因素的影响 | 更高的可重复性 |
| 统计能力 | 降低 | 更高 |
| 协议成熟度 | 良好的协议 | 从qPCR轻松过渡，但协议仍在开发 |
| 吞吐量 | 高的 | 降低 |
数字PCR（DPCR）和下一代测序（NGS）之间的比较
NGS 是广泛发现的理想选择，可以识别出广泛的遗传变异和生物标志物，而没有事先了解突变。对于全面的而言，它是基础的 DPCR ，提供了特定目标的超敏感验证和精确量化，使其适合跟踪已知突变或稀有变体，尤其是在监测治疗反应方面。
| NGS | 数字PCR | 数字PCR |
| 检测极限 | WGS和WES的10％-5％ | 0.1％-0.001％ |
| 数据分析 | 广泛的生物信息学支持，要求数据解释 | 直截了当 |
| 突变知识要求 | 不需要突变的先验知识 | 必需的 |
| 检测范围 | 数百至全基因组或整个基因组 | 有限的 |
| 定量 | 半定量 | 绝对定量 |
| 检测到的更改类型 | 整个基因组/面板上的拷贝数改变，结构重排，SNV或甲基化变化 | 在单个基因/区域可能 |
| 周转时间（tat） | 长的 | 短的 |
| 成本 | 高的 | 低的 |
这些技术通常集成到工作流程中：用于发现和分析的NG，然后是DPCR，用于对所选目标的敏感，定量监测。这种协同作用在精密医学，肿瘤学，传染病监测和基因检测中特别有价值。
数字PCR的应用
引用
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