2023年1月，布基纳法索卫生部实验室发表文章《对 SARS-CoV-2 的自动化 KingFisher Flex Purification System 96 (ThermoFisher Scientific) 和手动 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) 提取方法进行比较评估“ 在 非洲临床和实验微生物学杂志.
本研究探索建立新型COVID-19检测系统，使用Rainsure的COVID-19免提取试剂盒比较Qiagen和Kingfisher两个核酸提取平台的效率，重点关注COVID-19感染的快速分子检测。并作为病原检测的重要临床方法，确保对Covid-19感染患者进行快速、准确的筛查和诊断。本研究结果表明，KingFisher Flex Purification System 96 (ThermoFisher) 的自动提取方法的灵敏度和特异性低于 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) 的手动提取方法。
标题： 对 SARS-CoV-2 的自动化 KingFisher Flex Purification System 96 (ThermoFisher Scientific) 和手动 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) 提取方法进行比较评估
杂志： ”非洲临床和实验微生物学杂志'
单位：布基纳法索卫生部
发布日期：2023 年 1 月
研究平台：Rainsure新型冠脉提取免费试剂盒
SARS-CoV-2标本的核酸提取效率直接影响逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测结果的质量，导致新冠肺炎诊断的错误。本横断面研究的目的是评估自动提取系统 KingFisher Flex Purification System 96 (ThermoFisher) 与 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) 手动提取方法的诊断性能。
2020年10月至2020年12月，从布基纳法索疑似输入性冠状病毒病例或患者接触者中采集标本，检测159份新鲜鼻咽拭子标本和120份冷冻鼻咽拭子标本。采用Rainsure的FastPlexTM Triplex 1-Step COVID 19检测试剂盒（RT-PCR，免RNA提取）对两种方法提取的产物进行检测，并在QuantStudio5热循环仪（Applied Biosystems）中完成PCR扩增。使用在线OpenEpi软件完成了两种方法提取RNA后SARS-CoV-2 RT-PCR检测诊断性能的分析（图1）。
图 1：新鲜样品 (a) 和冷冻样品 (b) 的分析步骤流程图
FastPlexTM Triplex 1-Step COVID 19 检测试剂盒（RT-PCR，RNA 免提取）用于在同一 PCR 板上扩增 KingFisher Flex Purification System 96 (ThermoFisher) 和 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)）通过两个方法获得的两种 RNA方法中，扩增试剂盒的基因靶点包括：ORF1ab（FAM荧光染料）和N（HEX荧光染料）和内参（CY5荧光染料）（表1）。
表1：RT-PCR结果表
对于新鲜样本，研究发现手动提取后RT-PCR的阳性率略高于自动提取（12.6% vs 9.4%）。对于冷冻样品，手动提取的阳性率远高于自动提取方法（38.33% vs 20.83%）。结果表明，对于新鲜样品（敏感性35%，特异性94.2%）和冷冻样品（敏感性43.5%，特异性93.2%），自动提取方法的效果不如手动提取。但经McNemar's检验并Yates校正后，对于新鲜样品，两种提取方法的RT-PCR阳性率无显着性差异（x2=0.76，p=0.38），而冷冻样品则有显着性差异（x2=12.9，p=0.0003）。
研究发现，手工提取新鲜样本的RT-PCR阳性率（12.6%，20/159）略高于自动提取的RT-PCR阳性率（9.4%，15/159）。7 个样本（4.4%）在手动和自动提取中均呈阳性，而 131 个样本（82.4%）呈阴性。与手动提取相比，自动提取的特异度为94.2%，敏感性为35.0%，新鲜样品的PPV为46.7%，NPV为90.9%，但使用带有Yates校正的McNemar检验，两者之间没有差异。新鲜样品的两种提取方法。显着差异（x2=0.76，p=0.38）（表2a）。
表2a：自动和手动提取新鲜样品后RT-PCR结果的对比评估
对于冷冻样本，RT-PCR阳性率存在显着性差异，其中手动提取法为（38.33%，46/120），自动提取法为（20.83%，25/120）（x2 =12.9，p=0.0003）。手动和自动提取均有 20 个样本（16.7%）呈阳性，69 个样本呈阴性（57.5%）。与手动提取相比，自动提取的特异性为93.24%，敏感性为43.48%，PPV为80.0%，NPV为72.63%（表2b）。
表2b：自动和手动提取冷冻样品后RT-PCR结果的对比评估
对于新鲜样本，自动提取系统KingFisher Flex Purification System 96（ThermoFisher）与QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）手动提取方法相比，ORF1ab和N基因的扩增倍数分别为2.36和0.81倍，具有统计学意义显着差异。然而，两者的N基因平均Ct值没有显着差异（p=0.1319）。此外，平均 Ct 值之间没有显着差异。 内参基因的数量 (p=0.4939)（表 3）。
表3：新鲜和冷冻样品提取后SARS-COV-2基因RT-PCR的平均Ct值
与QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）的手动提取方法相比，自动提取系统KingFisher Flex Purification System 96（ThermoFisher）的ORF1ab平均Ct值没有显着差异（p=0.09885）。同样，平均 Ct 值之间没有显着差异 两者之间自动提取的 N 基因的数量 (p=0.0594)。此外，平均 Ct 值之间没有显着差异。 内参基因的数量 (p=0.1045)（表 3）。
本研究结果表明，自动提取系统 KingFisher Flex Purification System 96 (ThermoFisher) 的灵敏度和特异性低于 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) 手动提取方法。这些数据可以作为实验室选择用于RT-PCR检测SARS-CoV-2的RNA提取方法的指导信息。